METODE ANALISIS
IDENTIFIKASI BAHAN PEWARNA YANG DILARANG DALAM KOSMETIKA
SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) DAN
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
A. IDENTIFIKASI SECARA KLT
1. Ruang lingkup
Metode ini menguraikan prosedur untuk identifikasi bahan pewarna yang dilarang dalam kosmetika, yaitu:
2. Prinsip
Bahan pewarna yang dilarang dalam kosmetika diekstraksi dan diidentifikasi secara KLT.
3. Baku Pembanding (BP)
3.1 Jingga K1 BP
3.2 Kuning metanil BP
3.3 Merah K10 (Rhodamine B) BP
4. Pereaksi
Semua pereaksi yang digunakan harus pro analisis.
4.1 Air destilasi
4.2 Amonia 25%
4.3 Asam asetat glasial
4.4 Asam ortofosfat 85%
4.5 n-butanol
4.6 Diklorometan
4.7 N,N-dimetilformamida (DMF)
4.8 Etanol 96%
4.9 Etil asetat
4.10 n-heksan
4.11 Isobutanol
4.12 Isopropanol
4.13 Metanol
4.14 Petroleum eter (antara 40-60°C atau 60-80°C)
4.15 Pelarut campur: campuran N,N-dimetilformamida - asam ortofosfat (95:5) v/v yang dibuat baru.
4.16 Larutan pengembang:
Pewarna larut minyak dikembangkan dengan larutan pengembang Sistem A dan pewarna larut air dengan larutan pengembang lainnya.
4.16.1 Sistem A : diklorometan
4.16.2 Sistem B : campuran etil asetat-metanol-[amonia 25% - air (3:7)] (15:3:3) v/v/v yang dibuat baru.
4.16.3 Sistem C: campuran etanol-air-isobutanol-amonia 25% (31:32:40:1) v/v/v/v
4.16.4 Sistem D: campuran isopropanol-amonia 25% (100:25) v/v
4.16.5 Sistem E: campuran n-butanol - etanol - air - asam asetat glasial (60:10:20:0,5) v/v/v/v
4.16.6 Sistem F: campuran etil asetat - n-butanol - amonia 25 % (20:55:25) v/v/v
5. Peralatan
Peralatan laboratorium yang umum digunakan, dan
5.1 Lempeng KLT silika gel 60 F254 siap pakai, ukuran 20 cm x 20 cm, tebal 0,25 mm
5.2 Bejana kromatografi
5.3 Pipa kapiler Micropipette (1-5 µL)
5.4 Kertas saring
5.5 Penyaring membran PTFE, diameter 13 mm, porositas 0,45 µm, atau yang setara
5.6 Vortex mixer
5.7 Lampu UV 254 nm dan 366 nm
5.8 Tangas air
6. Prosedur
6.1 Penyiapan larutan baku
(Catatan: Larutan baku yang pekat, akan memberikan bercak tambahan)
6.1.1 Larutan baku bahan pewarna larut minyak
Timbang saksama sejumlah Jingga K1 BP, larutkan dalam diklorometan atau pelarut campur hingga kadar 0,1 mg/mL dan sonikasi sampai homogen.
6.1.2 Larutan baku bahan pewarna larut air
Timbang saksama sejumlah Kuning Metanil BP, dan Merah K10 BP, masing-masing dilarutkan dan diencerkan dengan metanol atau DMF atau pelarut campur hingga kadar 0,2 mg/mL.
6.2 Penyiapan larutan uji
6.2.1 Produk kosmetika berwarna
Timbang saksama lebih kurang 0,1 g – 0,3 g contoh dan larutkan dalam 2 mL pelarut campur.
6.2.1.1 Untuk contoh yang diduga mengandung Jingga K1:
Lakukan ekstraksi dengan diklorometan. Jika perlu, panaskan pada suhu 90°C selama 1 jam atau sampai larut.
6.2.1.2 Untuk contoh kosmetika yang mengandung minyak :
Lakukan ekstraksi lemak 2 kali, setiap kali dengan 5 mL n-heksan. Kumpulkan ekstrak n-heksan. Jika ekstrak berwarna, ekstraksi kembali dengan 2 mL pelarut campur dan buang lapisan n-heksan. Saring lapisan pelarut campur melalui penyaring membrane dengan porositas 0,45 µm. Gunakan filtrat sebagai larutan uji.
6.2.2 Sediaan mandi dan produk kosmetika berbasis air lainnya
6.2.2.1 Timbang saksama lebih kurang 1 sampai 5 g contoh (tergantung konsentrasi warna pada contoh), tambahkan 20 mL DMF dan panaskan di atas tangas air selama 10 menit. Biarkan pada suhu ruang hingga dingin dan saring melalui kertas saring Whatman (kecepatan sedang sampai tinggi). Pewarna organic akan larut dalam DMF.
6.2.2.2 Lakukan ekstraksi terhadap lapisan DMF dengan 40 mL petroleum eter untuk menghilangkan kelebihan minyak. Uapkan lapisan DMF di atas tangas air sampai kering.
6.2.2.3 Jika lapisan petroleum eter berwarna, menunjukkan adanya pewarna larut minyak. Uapkan lapisan petroleum eter sampai kering.
6.3 Prosedur KLT
6.3.1 Produk kosmetika berwarna
6.3.1.1 Lapisi bejana KLT menggunakan kertas saring, jenuhkan bejana KLT dengan larutan pengembang yang sesuai.
6.3.1.2 Siapkan lempeng KLT dengan membuat batas penotolan dan batas eluasi lebih kurang 15 cm, kecuali untuk larutan pengembang sistem A, lebih kurang 11 cm.
6.3.1.3 Totolkan secara terpisah, masing-masing 1 μL sampai 5 μL larutan baku dan sejumlah volume sama larutan uji (tergantung kepekatan warna) pada batas penotolan.
6.3.1.4 Kembangkan lempeng dalam masing-masing bejana kromatografi yang berisi larutan pengembang sampai batas eluasi pada suhu ruang.
6.3.1.5 Angkat lempeng dan keringkan pada suhu ruang.
6.3.2 Sediaan mandi dan produk kosmetika berbasis air lainnya (gel dan larutan)
6.3.2.1 Larutkan residu (lihat 6.2.2.2 dan 6.2.2.3) dengan 0,5- 1 mL metanol dan saring melalui penyaring membrane dengan porositas 0,45 µm.
6.3.2.2 Totolkan secara terpisah, sejumlah volume sama (1 μL sampai 5 μL) larutan baku dan larutan uji pada batas penotolan.
6.3.2.3 Untuk bahan pewarna larut air (kuning metanil, dan merah K10), kembangkan lempeng sampai batas eluasi, dalam masing-masing bejana kromatografi yang berisi larutan pengembang sistem B sampai sistem F.
6.3.2.4 Untuk bahan pewarna larut minyak (jingga K1), kembangkan lempeng sampai batas eluasi lebih kurang 11 cm dalam bejana kromatografi yang berisi larutan pengembang sistem A. Untuk pengujian pendahuluan, dapat digunakan larutan pengembang sistem B.
6.3.2.5 Angkat lempeng dan keringkan pada suhu ruang.
7. Identifikasi
7.1 Hitung nilai Rf untuk masing-masing bercak.
7.2 Bandingkan nilai Rf dan warna bercak pada pengamatan secara visual yang diperoleh dari larutan uji dan larutan baku.
7.3 Amati bercak Merah K10 (Rhodamine B) di bawah penyinaran lampu UV, bercak berwarna terang yang menunjukkan adanya pewarna golongan ksanten.
7.4 Nilai Rf yang tertera dalam tabel dibawah ini, merupakan harga perkiraan yang mungkin diperoleh :
7.5 Buat kesimpulan awal mengenai identitas bahan pewarna. Jika tampak bercak bahan pewarna yang dilarang dalam contoh, lakukan pengujian lebih lanjut secara KCKT seperti yang tertera pada bagian B
(Catatan: Untuk pemurnian lebih lanjut, larutan pewarna dapat digoreskan sebanyak yang dapat dilakukan, untuk membentuk pita pada batas penotolan lempeng KLT. Kembangkan lempeng dalam bejana kromatografi yang berisi larutan pengembang sistem A untuk menghilangkan minyak. Lempeng yang sama dapat dikembangkan lebih jauh dengan larutan pengembang sistem B yang akan memisahkan bahan pewarna larut air. Kerok masing-masing pita pada lempeng KLT dan masukkan secara terpisah ke dalam Beaker glass. Lakukan ekstraksi bahan pewarna dari silika gel pada masing-masing pita dengan metanol, saring dan uapkan filtrat sampai kering. Lanjutkan pengujian seperti yang tertera pada 6.3).
8. Keterangan mengenai batas deteksi
B. IDENTIFIKASI SECARA KCKT
1. Ruang lingkup
Metode ini menguraikan prosedur untuk identifikasi bahan pewarna yang dilarang dalam kosmetika, yaitu:
2. Prinsip
Bahan pewarna yang dilarang dalam kosmetika diidentifikasi secara kromatografi cair fase balik dengan deteksi cahaya tampak.
3. Baku Pembanding (BP)
3.1. Jingga K1 BP
3.2. Kuning metanil BP
3.3. Merah K10 (Rhodamine B) BP
4. Pereaksi
Semua pereaksi yang digunakan harus pro analisis atau derajat kemurnian KCKT.
4.1 Air bidestilasi
4.2 Asam ortofosfat 85%
4.3 Diklorometan
4.4 Kalium hidroksida
4.5 Metanol
4.6 N,N-Dimetilformamida (DMF)
4.7 n-heksan
4.8 Larutan tetrabutilamonium hidroksida (TBA) 20%
4.9 Pelarut campur: campuran N,N-dimetilformamida-asam ortofosfat (95:5) v/v yang dibuat baru.
5. Peralatan
Peralatan laboratorium yang umum digunakan dan
5.1 KCKT dengan detektor berbagai panjang gelombang cahaya tampak dan detektor Photo Diode Array (PDA)
5.2 Penyaring membran PTFE, diameter 13 mm, porositas 0,45 µm, atau yang setara
5.3 Penyaring nilon, porositas 0,45 µm atau yang setara
5.4 Vortex mixer atau tangas ultrasonik
5.5 Tangas air
5.6 Kertas saring, Whatman (medium sampai cepat)
6. Prosedur
6.1 Penyiapan larutan baku
6.1.1 Larutan baku bahan pewarna larut minyak
Timbang saksama sejumlah Jingga K1 BP larutkan dalam diklorometan atau pelarut campur hingga kadar 0,1 mg/mL dan sonikasi selama setengah jam atau sampai larut.
6.1.2 Larutan baku bahan pewarna larut air
Timbang saksama sejumlah Kuning Metanil BP dan MerahK10 (Rhodamine B) BP, masing-masing dilarutkan dan diencerkan dengan metanol atau N,N-dimetilformamida atau pelarut campur hingga kadar 0,2 mg/mL.
6.2 Penyiapan larutan uji
Lakukan seperti yang tertera pada 6.2 dalam bagian A (Identifikasi secara KLT).
6.3 Prosedur KCKT
6.3.1 Fase gerak
6.3.1.1 Buat campuran larutan tetrabutilamonium 0,005 M - air (75:25) v/v
6.3.1.2 Buat larutan tetrabutilamonium 0,5 M, sebagai berikut:
- Larutkan 2,8 g kalium hidroksida dalam 10 mL air.
- Masukkan ke dalam labu tentukur 100-mL.
- Tambahkan 65 mL larutan tetrabutilamonium hidroksida 20%, encerkan dengan air sampai tanda.
- Atur pH hingga 7 dengan penambahan asam ortofosfat.
6.3.1.3 Buat larutan tetrabutilamonium 0,005 M sebagai berikut:
Pipet 10 mL larutan tetrabutilamonium 0,5 M ke dalam labu tentukur 1000-mL, encerkan dengan methanol sampai tanda. Larutan menjadi keruh. Biarkan mengendap selama beberapa jam dan saring melalui penyaring membran dengan porositas 0,45 µm.
6.3.2 Kondisi
Suhu oven kolom : 30°C
Kolom : kolom baja tahan karat berisi oktadesil- silana C18, ukuran partikel 5 μm, 200 x 4,6 mm atau yang setara
Laju alir : 1 mL/menit
Detektor : 435 nm dan 535 nm
Rentang spektra detektor : 275 sampai 760 nm
PDA
Volume injeksi : 20 °L
Waktu analisis : 35 menit
6.3.3 Suntikkan secara terpisah larutan baku dan larutan uji ke dalam kromatograf. Amati dan catat kromatogram. Ukur luas puncak. Bandingkan waktu retensi yang diperoleh dari kromatogram larutan uji dengan larutan baku.
7. Identifikasi
7.1 Bandingkan waktu retensi dan spektrum yang diperoleh dari kromatogram larutan uji dengan larutan baku. Waktu retensi dan spektrum yang sama antara larutan uji dengan larutan baku, menunjukkan adanya bahan pewarna dimaksud.
7.2 Panjang gelombang detektor dan waktu retensi baku bahan pewarna, sebagai berikut.
Catatan :
- Kromatogram dan waktu retensi harus memberikan factor kemiripan lebih dari 90%.
- Jika diduga mengandung bahan pewarna, tambahkan baku bahan pewarna ke dalam contoh. Puncak tunggal harus diperoleh untuk puncak yang diduga dan puncak baku bahan pewarna.
- Gunakan detektor Spektrometri Massa untuk konfirmasi.
8. Keterangan mengenai batas deteksi
C. KESIMPULAN
Hasil dari pengujian KLT dan KCKT dapat digunakan untuk menyimpulkan adanya bahan pewarna yang dilarang dalam kosmetika.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar