METODE ANALISIS
IDENTIFIKASI ASAM RETINOAT DALAM KOSMETIKA
SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) DAN KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI (KCKT)
A. IDENTIFIKASI SECARA KLT
1. Ruang lingkup
Metode ini menguraikan prosedur untuk identifikasi asam retinoat dalam kosmetika.
(Perhatian: Pada saat penanganan larutan baku dan contoh, seluruh personel terutama wanita hamil atau diduga hamil harus memperhatikan keamanan penanganan berbagai senyawa retinoat).
2. Prinsip
Asam retinoat diidentifikasi secara KLT.
3. Baku Pembanding (BP)
Asam retinoat BP. Simpan dibawah nitrogen dan terlindung dari cahaya, pada suhu ruang.
4. Pereaksi
Semua pereaksi yang digunakan harus pro analisis.
4.1 Asam asetat glasial
4.2 Asam fosfomolibdat
4.3 Aseton
4.4 Etanol mutlak
4.5 Dietil eter
4.6 n-heksan
4.7 Metanol
4.8 Gas nitrogen
4.9 Sikloheksan
4.10 Larutan pengembang :
4.10.1 Sistem A: campuran n-heksan - asam asetat glasial 0,33% dalam etanol mutlak (9:1) v/v
4.10.2 Sistem B: campuran n-heksan - aseton (6:4) v/v
4.10.3 Sistem C: campuran sikloheksan - eter - aseton - asam asetat glasial (54:40:4:2) v/v/v/v
4.11 Larutan penampak bercak: asam fosfomolibdat 5% dalam etanol mutlak yang harus dibuat baru (berupa cairan jernih berwarna kuning).
5. Peralatan
Peralatan laboratorium yang umum digunakan dan
5.1 Bejana kromatografi
5.2 Kertas saring Whatman no. 41 atau yang setara
5.3 Lampu UV 254 nm
5.4 Lempeng KLT silika gel 60F254 siap pakai, 20 cm x 20 cm, tebal 0,25 Mm
5.5 Penyaring membran PTFE (Politetrafluoroetilen) porositas 0,45 μm atau yang setara
5.6 Peralatan gelas tahan cahaya
5.7 Peralatan penampak bercak
5.8 Tabung sentrifus bertutup 30 mL
5.9 Vortex mixer
6. Prosedur
(Catatan: Penimbangan dan pemipetan pada saat pembuatan larutan baku dan larutan uji harus dilakukan secara cepat dan hindarkan dari cahaya untuk meminimalkan penguraian asam retinoat. Jika tidak tersedia peralatan gelas tahan cahaya, tabung dan bejana dapat dibungkus dengan aluminium foil).
6.1 Penyiapan larutan baku
Timbang saksama lebih kurang 0,01 g Asam retinoat BP, masukkan ke dalam labu tentukur 10-mL, larutkan dan encerkan dengan metanol sampai tanda.
6.2 Penyiapan larutan uji
6.2.1 Produk krim
Timbang lebih kurang 3 g contoh, masukkan ke dalam tabung sentrifus 30 mL, bungkus dengan aluminium foil, tambahkan 10 mL metanol dan campur menggunakan vortex mixer selama 5 menit. Dinginkan dalam es selama 15 menit dan saring melalui kertas saring Whatman no. 41 atau yang setara.
6.2.2 Produk berbasis air (larutan dan gel)
Timbang lebih kurang 10 g contoh, masukkan ke dalam corong pisah. Untuk contoh gel, tambahkan dalam 5 mL air. Ekstraksi larutan dengan 50 mL n-heksan dan cuci ekstrak n-heksan dengan 10 mL air. Uapkan ekstrak dengan hembusan gas nitrogen sampai kering. Larutkan residu dalam 1 mL methanol dan saring melalui penyaring membran PTFE dengan porositas 0,45 μm.
(Catatan: Gunakan penyaring membran berdiameter kecil.)
6.3 Prosedur KLT
6.3.1 Produk krim
6.3.1.1 Siapkan lempeng KLT dengan membuat batas penotolan dan batas eluasi lebih kurang 10 cm.
6.3.1.2 Totolkan secara terpisah, masing-masing 5 hingga 20 μL larutan uji dan 5 μL larutan baku pada batas penotolan dari lempeng KLT.
6.3.1.3 Kembangkan lempeng dalam bejana kromatografi yang berisi larutan pengembang sistem A. Angkat lempeng dan biarkan hingga kering. Amati bercak gelap di bawah penyinaran lampu UV.
6.3.1.4 Semprot dengan larutan penampak bercak, akan tampak bercak berwarna biru tua pada nilai Rf yang menunjukkan adanya asam retinoat.
6.3.1.5 Hembuskan udara panas pada lempeng, akan tampak bercak berwarna hijau kebiruan dari asam retinoat.
6.3.1.6 Jika hasil positif, menunjukkan adanya asam retinoat. Ulangi pengujian seperti yang tertera pada 6.3.1.1 hingga 6.3.1.5 menggunakan larutan pengembang sistem B.
6.3.2 Produk berbasis air
6.3.2.1 Isi dan jenuhkan bejana kromatografi dengan larutan pengembang sistem C yang dilapisi dengan kertas saring.
6.3.2.2 Totolkan secara terpisah, masing-masing 5 hingga 20 μL larutan uji dan 5 μL larutan baku pada garis awal dari lempeng KLT. Biarkan sampai bercak kering.
6.3.2.3 Kembangkan lempeng sampai jarak rambat pengembang kurang lebih 15 cm.
6.3.2.4 Keringkan lempeng di udara dan amati lempeng di bawah penyinaran lampu UV 254 nm. Semprot lempeng dengan larutan penampak bercak.
6.3.2.5 Hembuskan udara panas pada lempeng, akan tampak bercak berwarna hijau kebiruan dari asam retinoat.
6.3.2.6 Bandingkan nilai Rf dan warna bercak yang diperoleh dari larutan uji dengan larutan baku.
7. Identifikasi
7.1 Hitung nilai Rf untuk masing-masing bercak Nilai Rf = Jarak tempuh bercak/Jarak tempuh larutan pengembang
7.2 Bandingkan bercak yang diperoleh dari larutan uji dengan larutan baku berdasarkan nilai Rf, warna bercak dibawah penyinaran lampu UV dan warna bercak setelah visualisasi dengan penyemprotan larutan penampak bercak.
7.3 Lakukan pengujian lebih lanjut secara KCKT, seperti yang tertera pada bagian B dan bandingkan waktu retensi yang diperoleh dari puncak larutan uji dengan larutan baku.
B. IDENTIFIKASI SECARA KCKT
1. Ruang lingkup
Metode ini menjelaskan prosedur untuk identifikasi asam retinoat dalam
kosmetika.
2. Prinsip
Asam retinoat diidentifikasi secara kromatografi cair fase balik dengan deteksi ultra violet.
3. Baku Pembanding (BP)
Asam retinoat BP. Simpan dibawah gas nitrogen dan terlindung dari cahaya.
4. Pereaksi
Semua pereaksi yang digunakan harus pro analisis dan sesuai untuk KCKT
4.1 Air bidestilasi, 18 Mohm
4.2 Asam asetat glasial
4.3 Metanol
4.4 Fase gerak: campuran metanol-air-asam asetat glasial (85:15:0,5) v/v/v
5. Peralatan
Peralatan laboratorium yang umum digunakan dan
5.1 Peralatan gelas tahan cahaya
5.2 Tabung sentrifus bertutup 30 mL
5.3 Vial berwarna coklat
5.4 KCKT dengan detektor ultra violet 353 nm
5.5 Kolom analitik: kolom baja tahan karat, 150 x 4,6 mm, berisi oktadesilsilana C18 dengan ukuran partikel 5 μm atau yang setara.
5.6 Penyaring membran PVDF(Polyvinylidene difluoride) porositas 0,45 μm atau yang setara
6. Prosedur
(Catatan: Penimbangan dan pemipetan pada saat pembuatan larutan baku dan larutan uji harus dilakukan secara cepat dan hindari cahaya untuk meminimalkan penguraian asam retinoat. Jika tidak tersedia peralatan gelas tahan cahaya, tabung dan bejana dapat dibungkus dengan alumunium foil).
6.1 Penyiapan larutan baku (larutan harus dibuat baru)
Timbang saksama lebih kurang 10 mg Asam retinoat BP, masukkan ke dalam labu tentukur 10-mL, larutkan dalam 5 mL metanol, jika perlu sonikasi selama 1 hingga 2 menit dan encerkan dengan metanol sampai tanda (A). Buat pengenceran 1000 kali dengan cara: pipet 1 mL (A) ke dalam labu tentukur 10-mL, encerkan dengan metanol sampai tanda (B); pipet 1 mL (B) ke dalam labu tentukur 10- mL, encerkan dengan metanol sampai tanda (C); pipet 1mL (C) ke dalam labu tentukur 10-mL, encerkan dengan metanol sampai tanda (D). Larutan (D) yang digunakan sebagai larutan baku. (Catatan: Larutan ini digunakan dalam 24 jam.)
6.2 Penyiapan larutan uji
6.2.1 Produk Krim
Timbang lebih kurang 1 g contoh, masukkan ke dalam tabung sentrifus 30 mL yang dibungkus dengan alumunium foil, tambahkan 10 mL metanol dan campur menggunakan vortex mixer selama 5 menit. Dinginkan dalam es selama 15 menit dan saring melalui penyaring membran berdiameter kecil dengan porositas 0,45 μm. Kumpulkan filtrat dalam vial berwarna coklat, buang beberapa mL filtrat pertama. Gunakan filtrat sebagai larutan uji.
6.2.2 Larutan jernih
Saring larutan melalui penyaring membran berdiameter kecil dengan porositas 0,45 μm. Kumpulkan filtrat dalam vial berwarna coklat, buang beberapa mL filtrat pertama. Gunakan filtrat sebagai larutan uji.
6.3 Prosedur KCKT
6.3.1 Kondisi :
Suhu kolom : 30°C
Laju alir : 1,4 mL/menit
Detektor : UV 353 nm
Volume injeksi : 20 μL
6.3.2 Suntikkan secara terpisah larutan baku dan larutan uji ke dalam kromatograf.
6.3.3 Bandingkan waktu retensi yang diperoleh dari kromatogram larutan uji dengan larutan baku.
7. Perhitungan penetapan kadar
Gunakan luas puncak asam retinoat pada kromatogram untuk menghitung kadar dalam contoh. Hitung kadar asam retinoat % (b/b) dalam contoh, dengan rumus:
dimana:
Au = Luas puncak asam retinoat larutan uji
Ab = Luas puncak asam retinoat larutan baku
Bb = Bobot baku
Bu = Bobot contoh
Fu = Faktor pengenceran larutan uji
Fb = Faktor pengenceran larutan baku
Kb = Kemurnian baku
100 = Faktor konversi untuk persentase
8. Keterangan
8.1 Batas deteksi lebih kurang 0,002 mg/mL.
8.2 Larutan uji dan larutan baku harus dalam konsentrasi yang berdekatan untuk digunakan dalam perhitungan. Jika diperlukan, buat larutan baku yang lebih pekat atau larutan uji yang lebih encer. Perbedaan luas puncak larutan uji dan larutan baku tidak lebih dari 10%.
8.3 Identifikasi asam isoretinoat.
Metode ini dapat digunakan untuk identifikasi asam isoretinoat (asam retinoat bentuk 13-cis).
8.4 Untuk konfirmasi kemurnian puncak dapat digunakan detektor Photo Diode Array (PDA).
C. KESIMPULAN
Gabungkan hasil KLT dan KCKT untuk identifikasi adanya asam retinoat.
Sumber :
PERATURAN
KEPALA BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN
REPUBLIK INDONESIA
NOMOR HK.03.1.23.08.11.07331 TAHUN 2011
TENTANG
METODE ANALISIS KOSMETIKA
Tidak ada komentar:
Posting Komentar